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福建蘋(píng)果酸生物煉制研究進(jìn)展！
來(lái)源：www.zzjsyp.com 發(fā)布時(shí)間：2020年10月20日
蘋(píng)果酸較早是由Carl Wilhelm Scheele于1785年在蘋(píng)果汁中分離得到。蘋(píng)果酸結構上類(lèi)似于琥珀酸及富馬酸，其內在的四碳二元羧酸分子結構拓展了蘋(píng)果酸的用途，如廣泛用于食品添加劑、醫藥化工領(lǐng)域及作為聚蘋(píng)果酸的前體物質(zhì)等。
目前，大多數工業(yè)生產(chǎn)的蘋(píng)果酸通過(guò)化學(xué)合成方法制備，酶催化法合成僅占一小部分，直接發(fā)酵法合成更少?；瘜W(xué)合成方法通過(guò)加熱馬來(lái)酸得到蘋(píng)果酸；酶催化法通過(guò)微生物中分離得到的富馬酸酶轉化富馬酸得到蘋(píng)果酸，其中富馬酸是由石化資源制得的馬來(lái)酸轉化而來(lái)。酶催化法和化學(xué)方法的原料均來(lái)自石化資源。由可再生糖質(zhì)原料直接發(fā)酵轉化制備蘋(píng)果酸，雖然尚未在工業(yè)上廣泛應用，但顯示出了產(chǎn)品安全特性及原料供應豐富的巨大優(yōu)勢，正在獲得越來(lái)越多的關(guān)注和研發(fā)投入。目前，蘋(píng)果酸與琥珀酸、富馬酸共同被美國能源部列為未來(lái)12種頂-級生物基平臺化學(xué)品的首-位，因此，直接發(fā)酵法代表了蘋(píng)果酸生物煉制技術(shù)的未來(lái)。
1 蘋(píng)果酸生物煉制研究現狀
1.1 發(fā)酵原料的范圍研究
將可再生生物質(zhì)轉化為生物燃料、化學(xué)品及食品添加劑是當前生物化工領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)課題，許多不同類(lèi)型的生物質(zhì)水解產(chǎn)物均可用于制備蘋(píng)果酸。文獻報道：用玉米芯水解產(chǎn)物可生產(chǎn)蘋(píng)果酸；Rhizopus delemar菌株被用于轉化玉米秸稈水解物生產(chǎn)蘋(píng)果酸，也具有工業(yè)應用意義；其他生物質(zhì)也可被用于蘋(píng)果酸發(fā)酵。這些研究表明，蘋(píng)果酸生物煉制的原料范圍很廣。
1.2 菌種的篩選研究
近年來(lái)，有17種微生物被用于蘋(píng)果酸轉化研究，這些微生物可分為3種類(lèi)型：細菌、酵母和絲狀真菌。細菌具有發(fā)酵周期短、生長(cháng)快的優(yōu)點(diǎn)，通常用于有機酸的工業(yè)發(fā)酵；作為模型微生物，酵母廣泛應用于酒精發(fā)酵領(lǐng)域，雖然酵母不是重要的蘋(píng)果酸生產(chǎn)菌種，但由于其代謝能力多樣，受到廣泛關(guān)注；絲狀真菌發(fā)酵蘋(píng)果酸較大的優(yōu)勢是營(yíng)養需求簡(jiǎn)單，利于產(chǎn)品分離。絲狀真菌是重要的蘋(píng)果酸產(chǎn)生菌，科研人員也多圍繞該類(lèi)菌種開(kāi)展研究。產(chǎn)蘋(píng)果酸菌株情況見(jiàn)表1。Jantama等發(fā)現，大腸桿菌KJ070能夠利用10%的葡萄糖在24 h內生產(chǎn)626 mmol的蘋(píng)果酸；Crtereal等研究表明，漢遜酵母具有較好的生產(chǎn)蘋(píng)果酸及其他多種四碳二元羧酸的潛力。
1.3 基本代謝路徑研究
類(lèi)似丁二酸及L-乳酸，蘋(píng)果酸的合成路徑引起人們重視，尤其是其工業(yè)化生產(chǎn)調控。作為四碳二羧酸重要的生產(chǎn)菌，大腸桿菌的代謝途徑被廣泛研究，也可通過(guò)琥珀酸產(chǎn)生菌的代謝修飾生產(chǎn)蘋(píng)果酸；酵母由于具有很好的pH值耐受性而被人們用于蘋(píng)果酸生產(chǎn)，13C同位素示蹤分析表明，Saccharomyces cerevisiae的蘋(píng)果酸累積通過(guò)丙酮酸的羧化、三羧酸循環(huán)及其逆循環(huán)合成而得；絲狀真菌米曲霉的13C同位素示蹤分析表明，線(xiàn)粒體內TCA循環(huán)(三羧酸循環(huán))的活性對蘋(píng)果酸的分泌貢獻較大。蘋(píng)果酸生物煉制的中心代謝途徑如圖1。分析表明，細菌中蘋(píng)果酸的通量主要來(lái)源于草酰乙酸的直接代謝；酵母菌中除了草酰乙酸的代謝外，部分蘋(píng)果酸來(lái)自TCA循環(huán)；絲狀真菌中除了草酰乙酸代謝和TCA循環(huán)代謝外，蘋(píng)果酸的通量也來(lái)自蘋(píng)果酸酶的直接催化以及乙醛酸循環(huán)的代謝。
1.4 關(guān)鍵酶研究
富馬酸酶是生產(chǎn)蘋(píng)果酸的重要酶，特別是由富馬酸為原料生產(chǎn)蘋(píng)果酸時(shí)。已在釀酒酵母中檢測到富馬酸酶，并且在面包酵母細胞中測量到其高比活性。蘋(píng)果酸酶在大腸桿菌中介導C3代謝物羧化成C4代謝中起重要作用。研究表明，也可以通過(guò)用修飾電級再生輔酶來(lái)生產(chǎn)蘋(píng)果酸。此外，在米曲霉中檢測到丙酮酸羧化酶和蘋(píng)果酸脫氫酶的活性也是影響蘋(píng)果酸通量高低的主要原因。
蘋(píng)果酸代謝的關(guān)鍵酶見(jiàn)表2。對這些關(guān)鍵酶的分析表明，產(chǎn)生蘋(píng)果酸的菌株具有固定CO2的能力，并且參與TCA和乙醛酸鹽循環(huán)的合成。
1.5 代謝改造策略研究
通過(guò)對蘋(píng)果酸代謝的全-面研究，尤其是全細胞優(yōu)化的研究，人們借助代謝途徑改造生產(chǎn)多種有機酸，包括C4蘋(píng)果酸。Ye等通過(guò)從Thermococcus kodakarensis中提取蘋(píng)果酸酶來(lái)構建體外人工蘋(píng)果酸合成途徑，發(fā)現其對葡萄糖的得率可以達到60%。
為了提高蘋(píng)果酸的產(chǎn)量，在大腸桿菌中實(shí)施了富馬酸還原酶的敲除以提升產(chǎn)物，根據蘋(píng)果酸的通量來(lái)源，削弱富馬酸酶可以增加蘋(píng)果酸的產(chǎn)量；同時(shí)富馬酸酶的過(guò)度表達也可以反過(guò)來(lái)從下游改善其代謝。對于釀酒酵母K-901H，Vid24p基因功能喪失導致了蘋(píng)果酸脫氫酶累積，進(jìn)而實(shí)現蘋(píng)果酸產(chǎn)率的提升。所有這些改造策略顯著(zhù)促進(jìn)產(chǎn)物代謝。蘋(píng)果酸代謝改造策略及效果如表3。
1.6 發(fā)酵工藝研究
對于發(fā)酵過(guò)程，通常采用3種類(lèi)型的發(fā)酵模型，包括深層發(fā)酵、固體發(fā)酵和酶催化。Zou等探討了深層發(fā)酵過(guò)程并進(jìn)行了總結。Penicillium sclerotiorum K302可以在有氧條件下高產(chǎn)蘋(píng)果酸鈣(92.0 g/L)，該深層培養工藝具有較大潛力。寄生曲霉CICC40365深層培養8 d可得到55.47 g/L的蘋(píng)果酸，黃曲霉A-TCC13697和米曲霉QM No.821則可通過(guò)固體發(fā)酵方法生產(chǎn)蘋(píng)果酸。酶生物催化和膜分離過(guò)程被應用于富馬酸和蘋(píng)果酸生物轉化。微生物電滲析與細胞催化相結合的方法也是一個(gè)亮點(diǎn)，該方法具有電耗低和外源電子利用的多種底物的優(yōu)點(diǎn)。
1.7 影響發(fā)酵的關(guān)鍵因子研究
影響發(fā)酵的主要因素包括溶解氧、中和劑、微生物形態(tài)、二氧化碳及細胞狀態(tài)等。
微生物在有氧(偶爾厭氧)條件下產(chǎn)生蘋(píng)果酸，其中溶解氧在細胞生長(cháng)中起關(guān)鍵作用。中和劑如Ca(OH)2、Na2CO3和CaCO3通常用于控制有機酸發(fā)酵過(guò)程中的pH值。添加50 g/L的CaCO3確保了釀酒酵母在整個(gè)蘋(píng)果酸發(fā)酵過(guò)程中保持很好的發(fā)酵指數，其中CaCO3通過(guò)保持恒定的pH值在蘋(píng)果酸生物合成中起重要作用。顯著(zhù)影響氧轉移速率的另一種情況是真菌的形態(tài)，當絲狀真菌在深層培養基中生長(cháng)時(shí)，在不同的發(fā)酵過(guò)程中形成不同類(lèi)型的形態(tài)。代謝網(wǎng)絡(luò )顯示蘋(píng)果酸積累的幾種途徑與CO2固定密切相關(guān)，因此CO2影響著(zhù)蘋(píng)果酸的發(fā)酵。對于蘋(píng)果酸生產(chǎn)菌大腸桿菌而言，CO2參與磷酸烯醇式丙酮酸及丙酮酸的羧化。在氮饑餓條件下對米曲霉中蘋(píng)果酸生產(chǎn)狀況研究表明，氮源亞適量反而會(huì )增加蘋(píng)果酸的代謝，這可能與TCA循環(huán)的代謝、細胞呼吸和溶解氧吸收間接相關(guān)。
2.1.1 同步糖化發(fā)酵研究
纖維素原料轉化為高附加值化學(xué)品(如蘋(píng)果酸)主要包括4個(gè)加工步驟：原料預處理、水解、發(fā)酵和產(chǎn)品回收。由于同步糖化發(fā)酵提高了產(chǎn)品的整體轉化效率，是未來(lái)蘋(píng)果酸生物煉制研究的重要發(fā)展趨勢。
2.1.2 提高細胞耐受性的改善策略研究
當碳源從葡萄糖擴展到生物質(zhì)糖時(shí)，必須考慮一系列抑-制劑和所產(chǎn)生的細胞耐受性或適應性。纖維素糖降解過(guò)程中形成或釋放多種細胞抑-制劑，特別是在預處理過(guò)程中。這些抑-制劑對微生物有一定的毒性和負面影響，例如形成的糠醛會(huì )導致細胞損傷。研究發(fā)現，參與硫同化途徑的4種基因轉錄水平能顯著(zhù)保護細胞免受糠醛氧化應激的影響，也可通過(guò)與質(zhì)膜密切相關(guān)的化學(xué)和遺傳擾動(dòng)來(lái)改善細胞對乙酸抑-制劑的耐受性。如果高濃度抑-制劑在發(fā)酵系統中積累，則需要脫毒。
2.1.3 五六碳糖共發(fā)酵研究
拓寬生物質(zhì)糖生物轉化蘋(píng)果酸的基質(zhì)范圍對其未來(lái)成功應用至關(guān)重要。EMP途徑的葡萄糖代謝已經(jīng)在大多數生物體中得到很好的應用，六碳糖(低聚糖、纖維二糖、淀粉、蔗糖和麥芽糖)都通過(guò)EMP途徑引入或參與葡萄糖代謝。五碳糖(木糖和阿拉-伯糖)是來(lái)自生物質(zhì)的水解糖中的重要糖成分，含量?jì)H次于葡萄糖。葡萄糖和木糖共同發(fā)酵蘋(píng)果酸對工業(yè)制備蘋(píng)果酸具有重要意義。六碳糖和五碳糖的共代謝途徑見(jiàn)圖2。
2.1.4 碳固定化的強化研究
CO2是溫室氣體的主要成分，在蘋(píng)果酸發(fā)酵過(guò)程中將CO2固定在磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸中會(huì )產(chǎn)生較大的益處。CO2的固定效率對蘋(píng)果酸的生產(chǎn)有積級作用，碳固定的關(guān)鍵酶主要涉及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、丙酮酸羧化酶和蘋(píng)果酸酶。Rhizopus delemar胞內的蘋(píng)果酸酶活性非常高，在蘋(píng)果酸的總產(chǎn)量中，突變菌株中檢測到20%的通量來(lái)自蘋(píng)果酸酶對CO2的直接固定化。
2.1.5 能量平衡改善代謝研究
對于蘋(píng)果酸合成的基本代謝，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和丙酮酸羧化酶合成途徑差異顯著(zhù)，丙酮酸被PC(丙酮酸羧化酶)催化為OAA(草酰乙酸)的過(guò)程凈消耗ATP。當在產(chǎn)生蘋(píng)果酸的菌株代謝中檢測到PEPCK和PC時(shí)，細胞的ATP能量平衡將起決定性作用；因此，在了解細胞能量供應時(shí)，分析能量平衡很關(guān)鍵。類(lèi)似琥珀酸等四碳二羧酸的發(fā)酵，能量不平衡也是菌種高產(chǎn)的瓶頸。當NADH(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-還原態(tài)，還原型輔酶Ⅰ)細胞供應不足時(shí)，可以通過(guò)氧化還原平衡和調節NADH/NAD+(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-氧化態(tài))比例提升系統能量的穩定；同時(shí)通過(guò)乙酰輔酶A代謝，可以另外獲得NADH，因此可以通過(guò)控制電子傳遞鏈來(lái)產(chǎn)生ATP。NADPH(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，還原型輔酶Ⅱ)則在水解糖(包括六碳糖和五碳糖)的蘋(píng)果酸生物轉化中起重要作用。如果一個(gè)菌株中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的代謝成功啟動(dòng)，這個(gè)關(guān)鍵途徑將產(chǎn)生雙倍還原力(NADPH)，以補償能量供應，并進(jìn)而緩解整體代謝還原力[H]的短缺(NADH和NADPH)，這是一種有效改善NADHP平衡的方法。
2.2 蘋(píng)果酸生物精煉研究的總體趨勢
2004年，美國能源部將蘋(píng)果酸列為未來(lái)高附加值生物基化學(xué)品的首-位，蘋(píng)果酸將廣泛應用于化工、食品和制藥等各領(lǐng)域。由于人體只能代謝L-型蘋(píng)果酸，研究人員已經(jīng)提出逐漸使用L-蘋(píng)果酸代替混合型DL-蘋(píng)果酸，特別是在食品和醫藥應用中，歐美已經(jīng)禁止混合型產(chǎn)品的亂用。由于大多數蘋(píng)果酸產(chǎn)品是通過(guò)化學(xué)方法合成的，而富馬酸酶的催化不是真正的一步發(fā)酵，并且反應中存在其他化學(xué)殘留的可能，因此，蘋(píng)果酸的一步法生物精煉技術(shù)具有重要發(fā)展前景。
未來(lái)蘋(píng)果酸生物煉制研究總體趨勢為，在原料利用上實(shí)現同步糖化發(fā)酵，利用細胞耐受性的改善提高其發(fā)酵適應性，并進(jìn)而提升碳糖的共發(fā)酵、碳固定化及能量平衡能力，以提升蘋(píng)果酸產(chǎn)量。
3 結束語(yǔ)
利用生物煉制手段轉化可再生糖制備蘋(píng)果酸具有重要意義，其未來(lái)的發(fā)展定位是將原來(lái)的淀粉質(zhì)糖水解系統逐漸過(guò)渡到纖維質(zhì)水解糖系統，而如何克服其生物轉化過(guò)程中的諸多限制因素至關(guān)重要。本文介紹和總結了蘋(píng)果酸生物煉制流程，包括原料選擇、菌種篩選、基本代謝路徑研究、關(guān)鍵酶研究、發(fā)酵工藝研究以及關(guān)鍵影響因子研究；同時(shí)，統籌分析了轉化生物體的內部代謝與外在條件之間的關(guān)聯(lián)，進(jìn)而提出蘋(píng)果酸生物轉化研究的發(fā)展趨勢，期望為蘋(píng)果酸生物精煉提供一定參考。
目前，大多數工業(yè)生產(chǎn)的蘋(píng)果酸通過(guò)化學(xué)合成方法制備，酶催化法合成僅占一小部分，直接發(fā)酵法合成更少?；瘜W(xué)合成方法通過(guò)加熱馬來(lái)酸得到蘋(píng)果酸；酶催化法通過(guò)微生物中分離得到的富馬酸酶轉化富馬酸得到蘋(píng)果酸，其中富馬酸是由石化資源制得的馬來(lái)酸轉化而來(lái)。酶催化法和化學(xué)方法的原料均來(lái)自石化資源。由可再生糖質(zhì)原料直接發(fā)酵轉化制備蘋(píng)果酸，雖然尚未在工業(yè)上廣泛應用，但顯示出了產(chǎn)品安全特性及原料供應豐富的巨大優(yōu)勢，正在獲得越來(lái)越多的關(guān)注和研發(fā)投入。目前，蘋(píng)果酸與琥珀酸、富馬酸共同被美國能源部列為未來(lái)12種頂-級生物基平臺化學(xué)品的首-位，因此，直接發(fā)酵法代表了蘋(píng)果酸生物煉制技術(shù)的未來(lái)。
1 蘋(píng)果酸生物煉制研究現狀
1.1 發(fā)酵原料的范圍研究
將可再生生物質(zhì)轉化為生物燃料、化學(xué)品及食品添加劑是當前生物化工領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)課題，許多不同類(lèi)型的生物質(zhì)水解產(chǎn)物均可用于制備蘋(píng)果酸。文獻報道：用玉米芯水解產(chǎn)物可生產(chǎn)蘋(píng)果酸；Rhizopus delemar菌株被用于轉化玉米秸稈水解物生產(chǎn)蘋(píng)果酸，也具有工業(yè)應用意義；其他生物質(zhì)也可被用于蘋(píng)果酸發(fā)酵。這些研究表明，蘋(píng)果酸生物煉制的原料范圍很廣。
1.2 菌種的篩選研究
近年來(lái)，有17種微生物被用于蘋(píng)果酸轉化研究，這些微生物可分為3種類(lèi)型：細菌、酵母和絲狀真菌。細菌具有發(fā)酵周期短、生長(cháng)快的優(yōu)點(diǎn)，通常用于有機酸的工業(yè)發(fā)酵；作為模型微生物，酵母廣泛應用于酒精發(fā)酵領(lǐng)域，雖然酵母不是重要的蘋(píng)果酸生產(chǎn)菌種，但由于其代謝能力多樣，受到廣泛關(guān)注；絲狀真菌發(fā)酵蘋(píng)果酸較大的優(yōu)勢是營(yíng)養需求簡(jiǎn)單，利于產(chǎn)品分離。絲狀真菌是重要的蘋(píng)果酸產(chǎn)生菌，科研人員也多圍繞該類(lèi)菌種開(kāi)展研究。產(chǎn)蘋(píng)果酸菌株情況見(jiàn)表1。Jantama等發(fā)現，大腸桿菌KJ070能夠利用10%的葡萄糖在24 h內生產(chǎn)626 mmol的蘋(píng)果酸；Crtereal等研究表明，漢遜酵母具有較好的生產(chǎn)蘋(píng)果酸及其他多種四碳二元羧酸的潛力。
1.3 基本代謝路徑研究
類(lèi)似丁二酸及L-乳酸，蘋(píng)果酸的合成路徑引起人們重視，尤其是其工業(yè)化生產(chǎn)調控。作為四碳二羧酸重要的生產(chǎn)菌，大腸桿菌的代謝途徑被廣泛研究，也可通過(guò)琥珀酸產(chǎn)生菌的代謝修飾生產(chǎn)蘋(píng)果酸；酵母由于具有很好的pH值耐受性而被人們用于蘋(píng)果酸生產(chǎn)，13C同位素示蹤分析表明，Saccharomyces cerevisiae的蘋(píng)果酸累積通過(guò)丙酮酸的羧化、三羧酸循環(huán)及其逆循環(huán)合成而得；絲狀真菌米曲霉的13C同位素示蹤分析表明，線(xiàn)粒體內TCA循環(huán)(三羧酸循環(huán))的活性對蘋(píng)果酸的分泌貢獻較大。蘋(píng)果酸生物煉制的中心代謝途徑如圖1。分析表明，細菌中蘋(píng)果酸的通量主要來(lái)源于草酰乙酸的直接代謝；酵母菌中除了草酰乙酸的代謝外，部分蘋(píng)果酸來(lái)自TCA循環(huán)；絲狀真菌中除了草酰乙酸代謝和TCA循環(huán)代謝外，蘋(píng)果酸的通量也來(lái)自蘋(píng)果酸酶的直接催化以及乙醛酸循環(huán)的代謝。
1.4 關(guān)鍵酶研究
富馬酸酶是生產(chǎn)蘋(píng)果酸的重要酶，特別是由富馬酸為原料生產(chǎn)蘋(píng)果酸時(shí)。已在釀酒酵母中檢測到富馬酸酶，并且在面包酵母細胞中測量到其高比活性。蘋(píng)果酸酶在大腸桿菌中介導C3代謝物羧化成C4代謝中起重要作用。研究表明，也可以通過(guò)用修飾電級再生輔酶來(lái)生產(chǎn)蘋(píng)果酸。此外，在米曲霉中檢測到丙酮酸羧化酶和蘋(píng)果酸脫氫酶的活性也是影響蘋(píng)果酸通量高低的主要原因。
蘋(píng)果酸代謝的關(guān)鍵酶見(jiàn)表2。對這些關(guān)鍵酶的分析表明，產(chǎn)生蘋(píng)果酸的菌株具有固定CO2的能力，并且參與TCA和乙醛酸鹽循環(huán)的合成。
1.5 代謝改造策略研究
通過(guò)對蘋(píng)果酸代謝的全-面研究，尤其是全細胞優(yōu)化的研究，人們借助代謝途徑改造生產(chǎn)多種有機酸，包括C4蘋(píng)果酸。Ye等通過(guò)從Thermococcus kodakarensis中提取蘋(píng)果酸酶來(lái)構建體外人工蘋(píng)果酸合成途徑，發(fā)現其對葡萄糖的得率可以達到60%。
為了提高蘋(píng)果酸的產(chǎn)量，在大腸桿菌中實(shí)施了富馬酸還原酶的敲除以提升產(chǎn)物，根據蘋(píng)果酸的通量來(lái)源，削弱富馬酸酶可以增加蘋(píng)果酸的產(chǎn)量；同時(shí)富馬酸酶的過(guò)度表達也可以反過(guò)來(lái)從下游改善其代謝。對于釀酒酵母K-901H，Vid24p基因功能喪失導致了蘋(píng)果酸脫氫酶累積，進(jìn)而實(shí)現蘋(píng)果酸產(chǎn)率的提升。所有這些改造策略顯著(zhù)促進(jìn)產(chǎn)物代謝。蘋(píng)果酸代謝改造策略及效果如表3。
1.6 發(fā)酵工藝研究
對于發(fā)酵過(guò)程，通常采用3種類(lèi)型的發(fā)酵模型，包括深層發(fā)酵、固體發(fā)酵和酶催化。Zou等探討了深層發(fā)酵過(guò)程并進(jìn)行了總結。Penicillium sclerotiorum K302可以在有氧條件下高產(chǎn)蘋(píng)果酸鈣(92.0 g/L)，該深層培養工藝具有較大潛力。寄生曲霉CICC40365深層培養8 d可得到55.47 g/L的蘋(píng)果酸，黃曲霉A-TCC13697和米曲霉QM No.821則可通過(guò)固體發(fā)酵方法生產(chǎn)蘋(píng)果酸。酶生物催化和膜分離過(guò)程被應用于富馬酸和蘋(píng)果酸生物轉化。微生物電滲析與細胞催化相結合的方法也是一個(gè)亮點(diǎn)，該方法具有電耗低和外源電子利用的多種底物的優(yōu)點(diǎn)。
1.7 影響發(fā)酵的關(guān)鍵因子研究
影響發(fā)酵的主要因素包括溶解氧、中和劑、微生物形態(tài)、二氧化碳及細胞狀態(tài)等。
微生物在有氧(偶爾厭氧)條件下產(chǎn)生蘋(píng)果酸，其中溶解氧在細胞生長(cháng)中起關(guān)鍵作用。中和劑如Ca(OH)2、Na2CO3和CaCO3通常用于控制有機酸發(fā)酵過(guò)程中的pH值。添加50 g/L的CaCO3確保了釀酒酵母在整個(gè)蘋(píng)果酸發(fā)酵過(guò)程中保持很好的發(fā)酵指數，其中CaCO3通過(guò)保持恒定的pH值在蘋(píng)果酸生物合成中起重要作用。顯著(zhù)影響氧轉移速率的另一種情況是真菌的形態(tài)，當絲狀真菌在深層培養基中生長(cháng)時(shí)，在不同的發(fā)酵過(guò)程中形成不同類(lèi)型的形態(tài)。代謝網(wǎng)絡(luò )顯示蘋(píng)果酸積累的幾種途徑與CO2固定密切相關(guān)，因此CO2影響著(zhù)蘋(píng)果酸的發(fā)酵。對于蘋(píng)果酸生產(chǎn)菌大腸桿菌而言，CO2參與磷酸烯醇式丙酮酸及丙酮酸的羧化。在氮饑餓條件下對米曲霉中蘋(píng)果酸生產(chǎn)狀況研究表明，氮源亞適量反而會(huì )增加蘋(píng)果酸的代謝，這可能與TCA循環(huán)的代謝、細胞呼吸和溶解氧吸收間接相關(guān)。
2.1.1 同步糖化發(fā)酵研究
纖維素原料轉化為高附加值化學(xué)品(如蘋(píng)果酸)主要包括4個(gè)加工步驟：原料預處理、水解、發(fā)酵和產(chǎn)品回收。由于同步糖化發(fā)酵提高了產(chǎn)品的整體轉化效率，是未來(lái)蘋(píng)果酸生物煉制研究的重要發(fā)展趨勢。
2.1.2 提高細胞耐受性的改善策略研究
當碳源從葡萄糖擴展到生物質(zhì)糖時(shí)，必須考慮一系列抑-制劑和所產(chǎn)生的細胞耐受性或適應性。纖維素糖降解過(guò)程中形成或釋放多種細胞抑-制劑，特別是在預處理過(guò)程中。這些抑-制劑對微生物有一定的毒性和負面影響，例如形成的糠醛會(huì )導致細胞損傷。研究發(fā)現，參與硫同化途徑的4種基因轉錄水平能顯著(zhù)保護細胞免受糠醛氧化應激的影響，也可通過(guò)與質(zhì)膜密切相關(guān)的化學(xué)和遺傳擾動(dòng)來(lái)改善細胞對乙酸抑-制劑的耐受性。如果高濃度抑-制劑在發(fā)酵系統中積累，則需要脫毒。
2.1.3 五六碳糖共發(fā)酵研究
拓寬生物質(zhì)糖生物轉化蘋(píng)果酸的基質(zhì)范圍對其未來(lái)成功應用至關(guān)重要。EMP途徑的葡萄糖代謝已經(jīng)在大多數生物體中得到很好的應用，六碳糖(低聚糖、纖維二糖、淀粉、蔗糖和麥芽糖)都通過(guò)EMP途徑引入或參與葡萄糖代謝。五碳糖(木糖和阿拉-伯糖)是來(lái)自生物質(zhì)的水解糖中的重要糖成分，含量?jì)H次于葡萄糖。葡萄糖和木糖共同發(fā)酵蘋(píng)果酸對工業(yè)制備蘋(píng)果酸具有重要意義。六碳糖和五碳糖的共代謝途徑見(jiàn)圖2。
2.1.4 碳固定化的強化研究
CO2是溫室氣體的主要成分，在蘋(píng)果酸發(fā)酵過(guò)程中將CO2固定在磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸中會(huì )產(chǎn)生較大的益處。CO2的固定效率對蘋(píng)果酸的生產(chǎn)有積級作用，碳固定的關(guān)鍵酶主要涉及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、丙酮酸羧化酶和蘋(píng)果酸酶。Rhizopus delemar胞內的蘋(píng)果酸酶活性非常高，在蘋(píng)果酸的總產(chǎn)量中，突變菌株中檢測到20%的通量來(lái)自蘋(píng)果酸酶對CO2的直接固定化。
2.1.5 能量平衡改善代謝研究
對于蘋(píng)果酸合成的基本代謝，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和丙酮酸羧化酶合成途徑差異顯著(zhù)，丙酮酸被PC(丙酮酸羧化酶)催化為OAA(草酰乙酸)的過(guò)程凈消耗ATP。當在產(chǎn)生蘋(píng)果酸的菌株代謝中檢測到PEPCK和PC時(shí)，細胞的ATP能量平衡將起決定性作用；因此，在了解細胞能量供應時(shí)，分析能量平衡很關(guān)鍵。類(lèi)似琥珀酸等四碳二羧酸的發(fā)酵，能量不平衡也是菌種高產(chǎn)的瓶頸。當NADH(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-還原態(tài)，還原型輔酶Ⅰ)細胞供應不足時(shí)，可以通過(guò)氧化還原平衡和調節NADH/NAD+(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-氧化態(tài))比例提升系統能量的穩定；同時(shí)通過(guò)乙酰輔酶A代謝，可以另外獲得NADH，因此可以通過(guò)控制電子傳遞鏈來(lái)產(chǎn)生ATP。NADPH(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，還原型輔酶Ⅱ)則在水解糖(包括六碳糖和五碳糖)的蘋(píng)果酸生物轉化中起重要作用。如果一個(gè)菌株中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的代謝成功啟動(dòng)，這個(gè)關(guān)鍵途徑將產(chǎn)生雙倍還原力(NADPH)，以補償能量供應，并進(jìn)而緩解整體代謝還原力[H]的短缺(NADH和NADPH)，這是一種有效改善NADHP平衡的方法。
2.2 蘋(píng)果酸生物精煉研究的總體趨勢
2004年，美國能源部將蘋(píng)果酸列為未來(lái)高附加值生物基化學(xué)品的首-位，蘋(píng)果酸將廣泛應用于化工、食品和制藥等各領(lǐng)域。由于人體只能代謝L-型蘋(píng)果酸，研究人員已經(jīng)提出逐漸使用L-蘋(píng)果酸代替混合型DL-蘋(píng)果酸，特別是在食品和醫藥應用中，歐美已經(jīng)禁止混合型產(chǎn)品的亂用。由于大多數蘋(píng)果酸產(chǎn)品是通過(guò)化學(xué)方法合成的，而富馬酸酶的催化不是真正的一步發(fā)酵，并且反應中存在其他化學(xué)殘留的可能，因此，蘋(píng)果酸的一步法生物精煉技術(shù)具有重要發(fā)展前景。
未來(lái)蘋(píng)果酸生物煉制研究總體趨勢為，在原料利用上實(shí)現同步糖化發(fā)酵，利用細胞耐受性的改善提高其發(fā)酵適應性，并進(jìn)而提升碳糖的共發(fā)酵、碳固定化及能量平衡能力，以提升蘋(píng)果酸產(chǎn)量。
3 結束語(yǔ)
利用生物煉制手段轉化可再生糖制備蘋(píng)果酸具有重要意義，其未來(lái)的發(fā)展定位是將原來(lái)的淀粉質(zhì)糖水解系統逐漸過(guò)渡到纖維質(zhì)水解糖系統，而如何克服其生物轉化過(guò)程中的諸多限制因素至關(guān)重要。本文介紹和總結了蘋(píng)果酸生物煉制流程，包括原料選擇、菌種篩選、基本代謝路徑研究、關(guān)鍵酶研究、發(fā)酵工藝研究以及關(guān)鍵影響因子研究；同時(shí)，統籌分析了轉化生物體的內部代謝與外在條件之間的關(guān)聯(lián)，進(jìn)而提出蘋(píng)果酸生物轉化研究的發(fā)展趨勢，期望為蘋(píng)果酸生物精煉提供一定參考。
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